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宏基因组测序与分析方法以及问题集锦(测序部分)

随着测序技术的不断发展,宏基因组研究也越来越多。下面整一份从网上收集来的宏基因组研究的资料,与大家分享。为了满足一下不懂宏基因组同学的好奇,顺带从百度百科上取来一份词条作为介绍。

定义

宏基因组 ( Metagenome)(也称微生物环境基因组 Microbial Environmental Genome, 或元基因组) 。是由 Handelsman 等 1998 年提出的新名词, 其定义为“the genomes of the total microbiota found in nature” , 即生境中全部微小生物遗传物质的总和。它包含了可培养的和未可培养的微生物的基因, 目前主要指环境样品中的细菌和真菌的基因组总和。而所谓宏基因组学 (或元基因组学, metagenomics) 就是一种以环境样品中的微生物群体基因组为研究对象, 以功能基因筛选和/或测序分析为研究手段, 以微生物多样性、 种群结构、 进化关系、 功能活性、 相互协作关系及与环境之间的关系为研究目的的新的微生物研究方法。(来自百度百科:http://baike.baidu.com/view/1939711.htm)

测序部分:

  • 宏基因组测序需要提供什么样品要求?

    (1)提供环境微生物的基因组DNA或者扩增产物,OD值在1.8~2.0 之间;样品浓度大于30 ng/l;每次样品制备需要4μg样品。

    和记娱乐网赌场 (2)DNA样品请置于-20℃保存;请提供DNA样品具体浓度、体积、制备时间、溶剂名称。请同时附上QC数据,包括电泳胶图、分光光度或Nanodrop仪器检测数据。

    和记娱乐网赌场 (3)样品请置于1.5 ml管中,管上注明样品名称、浓度以及制备时间,管口使用Parafilm封口。建议使用干冰运输,并且尽量选用较快的邮递方式,以降低运输过程中样品降解的可能性。

  • 宏基因组测序样品总DNA的提取及基因或基因组DNA的富集注意事项?

    和记娱乐网赌场 提取的样品DNA必须可以代表特定环境中微生物的种类,除需严格遵循取样规则外,取样中应尽量避免对样本的干扰,缩短保存和运输的时间,使样品尽可能代表自然状态下的微生物原貌,获得高质量环境样品中的总DNA是宏基因组文库构建的关键之一。要采用合适的方法,既要尽可能地完全抽提出环境样品中的DNA,又要保持较大的片段以获得完整的目的基因或基因簇。所以总的提取总是在最大提取量和最小剪切力之间折中。应严格操作,谨防污染,并且保持DNA 片段的完整和纯度。为了更好地反映环境中的微生物种群并且提高阳性克隆的占有率,需要在克隆之前通过不同的方法对感兴趣的目的基因或基因组进行富集,常用的富集方法有稳定同位素探针、抑制性消减杂交、差异显示、噬菌体展示、 亲和捕获及DNA微阵列等技术。

  • 采用Illumina Hiseq2000进行宏基因组测序,测序文库构建方法及质量控制如何?

    采用Illumina Hiseq2000进行宏基因组 DNA测序,首先对特定环境微生物种群全基因组DNA进行提取。在提取微生物种群的DNA后制备DNA文库,具体步骤如下:

    (1)将DNA随机打断成200-500bp的片段;

    (2)对DNA末端进行修复;

    (3)将“A”碱基加入到DNA片段的3’末端;

    (4)在DNA片段的末端加上接头;

    (5)纯化连接产物;

    (6)PCR扩增连上接头的DNA片段;

    和记娱乐网赌场 (7)检测测序文库。

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