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常见问题集锦

  • 可以对无参考基因组的物种进行Bisulfite研究吗?

    Bisulfite-Seq前提是只能适用于有参考基因组的物种,但是其强烈依赖于基因组的完整程度,基因组质量的好坏会直接影响其后续的分析结果,因此BS更适合有较完整基因组信息的物种。

  • 重测序需要多少覆盖度?

    重测序的覆盖度是由所测样品的物种及合作伙伴的具体需求决定的。例如,采用Hiseq2000进行人类基因组重测序,如要获得绝大多数的变异信息,覆盖度需达20×以上。

  • 微生物基因组测序的技术指标是什么?

    微生物基因组测序按测序精度大致可以分为框架图、精细图和完成图三类。框架图要求基因组覆盖度大于95%,基因区覆盖度达到98%以上,单碱基错误率低于十万分之一;精细图要求基因组覆盖度大于98%,基因区覆盖度达到99%以上,单碱基错误率低于十万分之一,gap数不超过100个;完成图要求完整基因组序列,单碱基错误率低于十万分之一,gap数不超过5个。
  • Bisulfite-Seq在项目开始之前需要考虑哪些因素?

    1) 是否为低甲基化率的物种;
    2) 该物种的基因组完成情况如何(影响 Bisulfite-Seq 的比对);
    3) 基因组是否存在复杂因素:GC 含量偏高、杂合度偏高、转座子、重复区域等
  • 人全基因组重测序应用在哪些方面?

    人类进化、比较基因组学等的研究:可利用全基因组的基因信息全面进行种族进化、种族特异性基因及区域的筛选;疾病研究:全基因组范围内搜寻疾病相关候选位点或区域,特别适合于有较少分子研究基础疾病类型的,或研究大的结构变异的情况。
  • 进行小RNA测序对于组织样品提取总RNA有什么特殊要求?

    RNA纯化方法主要包括有机溶剂抽提+乙醇沉淀、硅胶膜离心柱等。由于硅胶膜离心柱只能富集200nt以上的RNA分子,所以并不适用于small RNA的分离纯化。有机溶剂抽提虽然能够较好的保留small RNA,但是后期的沉淀步骤非常繁琐。因此,如果要进行小RNA测序,提取总RNA时建议不要使用Qiagen等公司的过柱试剂盒,也不要使用LiCl沉淀,以免丢失小片段RNA。如果直接提供小RNA样品,可以使用小RNA提取专用试剂盒来进行提取。
  • 小RNA测序对于提供的总RNA样品要求为什么比转录组测序样品要求还要高?

    如果采用total RNA进行小RNA文库构建,因total RNA中含有的小RNA量很少(约0.3%),且小片段RNA更易降解,所以只有严格的保证total RNA 完整性(即2100检测中的RIN值较高时),才能保证小RNA质量。
  • 如何对得到的数目较多的差异基因进行后期验证?

    根据KO、GO富集结果,选取有代表性的进行qRT-PCR验证;2. 根据RPKM值,选择RPKM值差异成倍数的基因进行qRT-PCR验证;3. 基迪奥公司会根据客户项目的特点,在对照设置、处理水平、分析策略(例如特征基因选择)等提供定制化方案设计,以进一步对差异基因进行过滤、分类,便于客户挑选重要的差异基因。
  • 人全基因组重测序一般推荐多少×测序深度?

    测序深度根据研究目的、样本量及合作伙伴的预期而定。30×测序深度左右即可鉴定绝大部分snps,但如果客户的研究目的是找癌组织中较大的结构变异,建议深度测序(一般至少50×以上);群体重测序可以使用较低深度测序(~10×),用群体分析策略寻找相关变异。
  • MeDIP-Seq没有参考基因组能否做?

    MeDIP-Seq需要有完整的参考基因组或者参考序列用作比对,基因组组装结果的好坏直接影响信息分析结果,如果没有参考基因组,可以选择近源物种或者转录组拼接的结果来作为参考基因组,但是会丢失一部分甲基化信息。
  • MeDIP方法能检测出每个位点的甲基化状态吗?

    MeDIP-Seq是基于抗体富集的DNA甲基化分析方法,通过测序富集的DNA片段在基因组上的分布而反映出相应区域的甲基化状态,由于无法确定富集下来的DNA片段中每个位点的C是否发生甲基化,也就无法得到单个碱基的甲基化水平。
  • 如何完成基因组中重复序列数据的准确拼接?

    通过构建不同长度测序文库并使用Roche 454 FLX+平台深度测序,可以对重复序列引起的错误进行校正。
  • ChIP-Seq对分析的物种有何要求?

    目前可接受的为有参考基因组的人、动物、植物和微生物等。但理论上,可以接受老师自行沉淀后的DNA进行建库、测序和分析。
  • 为什么small RNA不同的样品测序得到的reads 数量相差较大?为什么说不影响分析准确性?

    Small RNA在不同物种,以及同一物种不同组织、不同发育阶段表达情况都有差异,而通常用作total RNA 提取的材料的细胞数差异也很大(通常为10~100万个细胞),所以取材的时空性及细胞总数的多少决定了样品中表达的small RNA的总量不可能完全一致。分析时采用均一化后的数据,这样即使reads 数量相差较大,也不影响分析的准确性。
  • 转录组测序与基因表达芯片相比有哪些优势?

    与基因表达芯片相比,转录组测序具有如下优势:首先,应用范围广。转录组测序无需预先设计探针或了解物种的基因组信息,同样适用于基因组序列未知物种;第二,准确性高。基因芯片原理是基于核酸单链间的互补杂交,当杂交条件不同时,或者丢失低拷贝转录本信息,或者假阳性率高。而转录组测序是基于对转录本序列的测定,准确性很高,而且当测序深度足够时,能够检测到极低低丰度表达的转录本信息。第三,信息丰富。转录组测序除了可以用于基因组注释和基因转录表达分析,而且能发现新基因,检测可变剪切,SNPs,融合基因等。因此,转录组测序在诸多方面优于基因表达芯片,已经成为基因注释、表达检测和发现新基因等方面的主流技术。
  • 基因组框架图和精细图组装能达到什么程度?

    框架图能覆盖基因组常染色体区域90%,覆盖基因区域95%,contig N50达到5 kb,scaffold N50达到20 kb,单碱基错误率在十万分之一以下。
    精细图能覆盖基因组常染色体区域95%,覆盖基因区域98%,contig N50达到20 kb,scaffold N50达到300 kb,单碱基错误率在十万分之一以下。
  • 是否需要生物学重复?重复几次?

    需要根据具体情况来判断。基于高通量测序的组学研究(如RNA-seq)可以不设置生物学重复,或通过将若干生物学重复混合为一个样本后测序的策略,来部分弥补个体差异的影响(如 BMC genomics等SCI期刊上的相关研究普遍采取这个策略)。但随着测序价格不断下降,对多个生物重复样本的单独进行测序也逐渐成为高通量测序项目的趋势。如果设置重复,至少需要两次生物学重复,3次以上的生物学重复更好。2011年7月Hansen发表的文章表明生物学差异是基因自身表达的特性,与检测技术的选择以及数据处理的方式无关。如果不设生物学重复,高影响因子的杂志可能会因此而拒稿。
  • 人全基因组重测序的优势是什么?

    与外显子及RNA测序技术相比,技术流程简单而成熟,易操作,易实现;与外显子及目标区域捕获技术相比,可全面挖掘各种遗传变异,特别是一些大的结构变异,在全基因组范围内寻找与疾病或某功能相关的位点;与传统芯片分型技术相比,可发掘新的和稀有的变异。
  • 外显子组测序的优势?

    人外显子测序通过对人约1%的基因组区域进行捕获测序分析,在实现较低成本的前提下对发生突变后最有可能影响功能改变的序列进行针对性的研究,性价比高。另外,除外显子区域外,目前探针的设计还包括了大量small RNA及UTR非翻译区。
  • 如何使GC含量过高或过低物种的基因组测序达到相应组装标准?

    当GC含量大于65%或小于35%时测序难度均会增加,需要构建不同长度测序文库,并通过加大测序量才能够达到组装标准。
  • 转录组测序需要多少数据量?

    转录组测序所需的测序量随研究目的的不同而有所差异。目前,为保证数据分析结果的可靠性和准确性,推荐转录组测序采用最低4Gb clean data进行后续分析,如果想检测到低丰度的转录本推荐采用8Gb clean data。
  • MiSeq的测序质量与HiSeq相比如何?

    HiSeq与MiSeq都是Illumina公司推出的测序仪,而MiSeq是小型化测序仪的代表。HiSeq追求的是最高的通量,而MiSeq追求的是效率。HiSeq一个测序循环需要40分钟,MiSeq一个测序循环只要5分钟。但是MiSeq每个run测序通量很低,单位数据成本是HiSeq的几十倍至上百倍。根据我们多次测试结果,HiSeq测序质量与MiSeq测序质量没有差异。
  • 常染色体和性染色全基因组重测序测序深度的差异问题?

    如果所测样本为女性(XX),那么常染色体和性染色体重测序深度基本没有差异;如果所测样本为男性,因为性染色为XY, 因此在计算测序深度时是分开计算,其深度基本只有常染色体的一半;但由于X 染色体和Y染色体同源性比较高,X和 Y之间也会出现差异较大的情况。
  • 如何进行原核生物转录组分析?

    针对原核生物的mRNA没有poly A尾巴的情况,需要提供去除rRNA后经过纯化的原核生物mRNA或cDNA样品
  • 外显子组捕获测序中的捕获效率(capture specificity)及覆盖度(coverage ratio)分别指什么?哪个指标比较重要?

    捕获效率指比对到目标区域的有效数据量占总的数据量的比例。捕获效率的高低不影响数据质量,只影响数据的有效比例。覆盖度是目标区域被覆盖到的比率,是一般合作伙伴关心的指标。
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